小反刍兽疫是一种由小反刍兽疫菌引起的急性传染病，主要危害反刍兽类动物，严重影响畜牧业的发展。为了及时发现和控制小反刍兽疫的传播，需要对反刍兽类动物进行抗体检测。本标准介绍了小反刍兽疫抗体间接ELISA检测方法。

1. 要求
本标准适用于小反刍兽疫抗体间接ELISA检测方法。

2. 试剂
2.1 小反刍兽疫抗原：纯化的小反刍兽疫菌菌株。
2.2 小反刍兽疫抗体：兔抗小反刍兽疫抗体。
2.3 酶标记的二抗：抗兔IgG的辣根过氧化物酶标记的二抗。
2.4 TMB底物液：含有TMB的缓冲液。
2.5 停止液：含有硫酸的缓冲液。
2.6 洗涤缓冲液：含有Tween-20的缓冲液。
2.7 磷酸盐缓冲液：pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

3. 仪器设备
3.1 微孔板洗涤器。
3.2 微孔板读板器。
3.3 恒温振荡器。
3.4 离心机。

4. 操作程序
4.1 样品处理
将血清样品离心去除杂质，取上清液进行检测。样品需进行两倍稀释，即将1μL样品加入199μL磷酸盐缓冲液中，混匀后得到1:200稀释的样品。

4.2 微孔板涂布
将小反刍兽疫抗原稀释至1μg/mL，加入96孔微孔板中，每孔加入100μL，放置于4℃过夜。

4.3 洗板
将微孔板倒置，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次加入300μL，吸干后重复操作。

4.4 孵育
将微孔板加入100μL稀释后的样品，每孔加入100μL酶标记的二抗，放置于37℃恒温振荡器中孵育1小时。

4.5 洗板
将微孔板倒置，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次加入300μL，吸干后重复操作。

4.6 底物反应
将微孔板加入100μL TMB底物液，放置于37℃恒温振荡器中孵育15分钟。

4.7 停止反应
将微孔板加入100μL停止液，用微孔板读板器在450nm波长下测定吸光度值。

5. 结果判定
5.1 样品的抗体水平计算
将样品的吸光度值减去空白对照孔的吸光度值，得到样品的OD值。将样品的OD值除以阳性对照孔的OD值，得到样品的OD比值。根据OD比值和阳性对照孔的抗体水平，计算样品的抗体水平。

5.2 结果判定
样品的抗体水平大于等于阳性对照孔的抗体水平，即为阳性；小于等于阴性对照孔的抗体水平，即为阴性；介于阳性和阴性之间，需进行重测。

6. 质量控制
6.1 阳性对照孔和阴性对照孔的吸光度值应符合要求。
6.2 每批次检测应包括阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。

相关标准
GB/T 22470-2008 反刍兽疫抗体检测方法
GB/T 22471-2008 反刍兽疫抗原检测方法
GB/T 22472-2008 反刍兽疫病毒检测方法
GB/T 22473-2008 反刍兽疫病原体检测方法
GB/T 22474-2008 反刍兽疫疫苗检测方法