樱桃致死黄化病是由樱桃致死黄化病毒(Cherry lethal yellows virus,CLYV)引起的一种病害,主要危害樱桃、杏、桃等果树。为了及时发现和控制该病害的传播,需要对樱桃致死黄化病进行PCR检验鉴定。本标准旨在规范樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法,以提高检验鉴定的准确性和可靠性。
1.范围
本标准适用于樱桃致死黄化病的PCR检验鉴定。
2.样品采集
2.1 样品采集时间
样品采集时间应在果实发育期,以病果为主要采样对象。
2.2 样品采集方法
采用无菌剪刀或刀片将果实切开,取果核和果肉混合物作为样品。每个样品重量应在0.5g左右。
3.DNA提取
3.1 样品处理
将样品加入2mL离心管中,加入1mL CTAB提取液,混匀后加入0.1g玉米粉,混匀后在65℃水浴中振荡1h。
3.2 DNA提取
将样品离心,取上清液加入等体积的氯仿-异丙醇(24:1)混匀,离心后取上清液加入等体积的冷乙醇,混匀后放置-20℃冷冻箱中沉淀DNA,离心后去除上清液,加入70%乙醇洗涤,离心后去除上清液,将DNA干燥后加入TE缓冲液中溶解。
4.PCR扩增
4.1 扩增反应体系
扩增反应体系如下表所示:
| 成分 | 体积/质量 |
| ---- | ---- |
| 2×PCR Mix | 12.5μL |
| Primer F | 0.5μL |
| Primer R | 0.5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| ddH2O | 9.5μL |
4.2 扩增程序
扩增程序如下表所示:
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| ---- | ---- | ---- |
| 初始变性 | 95℃ | 5min |
| 循环扩增 | 95℃ | 30s |
| | 55℃ | 30s |
| | 72℃ | 30s |
| 终止延伸 | 72℃ | 10min |
4.3 扩增产物检测
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,观察扩增产物带型。
5.结果判定
5.1 阳性判定
出现预期大小的扩增产物带型,且带型清晰明显,即为阳性。
5.2 阴性判定
未出现预期大小的扩增产物带型,即为阴性。
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