副猪嗜血杆菌是一种常见的猪源性细菌，能引起猪的败血症、肺炎、关节炎等疾病，对猪养殖业造成了严重的经济损失。因此，对副猪嗜血杆菌的检测显得尤为重要。本标准旨在规范副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法，为猪养殖业提供可靠的检测手段。

1. 要求
本标准适用于副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法。

2. 试剂
2.1 酶标板：96孔酶标板。
2.2 抗原：副猪嗜血杆菌抗原。
2.3 抗体：抗猪IgG抗体。
2.4 酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG抗体。
2.5 底物：TMB底物液。
2.6 停止液：2mol/L硫酸。

3. 仪器设备
3.1 酶标仪：450nm波长酶标仪。
3.2 洗板机：自动洗板机。
3.3 移液器：1μL-1000μL可调移液器。

4. 操作程序
4.1 样品处理
4.1.1 血清样品：将血清样品离心去除杂质，取上清液。
4.1.2 组织样品：将组织样品加入PBS缓冲液中，制备10%的组织悬液，离心去除杂质，取上清液。
4.2 涂板
将副猪嗜血杆菌抗原加入96孔酶标板中，孵育过夜，洗板3次，加入5%的BSA阻断非特异性结合位点，孵育1小时，洗板3次。
4.3 反应
4.3.1 加样品：将样品加入孔中，孵育1小时。
4.3.2 加酶标记抗体：加入辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG抗体，孵育1小时。
4.4 洗板
洗板3次。
4.5 显色
加入TMB底物液，孵育15分钟。
4.6 停止反应
加入2mol/L硫酸停止反应。
4.7 测定
用450nm波长酶标仪测定吸光度值。

5. 结果判定
5.1 样品的抗体水平计算
样品的抗体水平=（样品OD值-空白对照OD值）/（阳性对照OD值-阴性对照OD值）×100%。
5.2 结果判定
样品的抗体水平≥阈值时，判定为阳性；否则，判定为阴性。

6. 质量控制
6.1 阳性对照：已知含有副猪嗜血杆菌抗体的血清样品。
6.2 阴性对照：未接触过副猪嗜血杆菌的血清样品。
6.3 空白对照：不加样品的孔。

相关标准
GB/T 22470-2008 猪副嗜血杆菌检验方法
GB/T 22471-2008 猪副嗜血杆菌病防治技术规范
GB/T 22472-2008 猪副嗜血杆菌病疫苗质量控制规范
GB/T 22473-2008 猪副嗜血杆菌病疫苗免疫程序
GB/T 22474-2008 猪副嗜血杆菌病疫苗接种后免疫效果评价