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一、范围
本标准适用于山银花中苜蓿的测定，适用于药材、中药饮片等样品的检验。

二、仪器设备和试剂
2.1 仪器设备
高效液相色谱仪：采用二元高压梯度泵、自动进样器、紫外检测器等。
色谱柱：C18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm。
2.2 试剂
甲醇：色谱纯。
乙腈：色谱纯。
磷酸二氢钾：分析纯。
磷酸：分析纯。
水：超纯水。

三、操作步骤
3.1 样品的制备
将山银花样品粉碎，过筛，取粉末0.5g，加入50ml甲醇，超声提取30min，离心，取上清液10ml，过滤，取滤液5ml，加入10ml乙腈，振荡混合，离心，取上清液2ml，即为待测样品液。
3.2 色谱条件
流动相：甲醇-0.05%磷酸二氢钾水溶液（30:70）。
流速：1.0ml/min。
检测波长：254nm。
柱温：25℃。
进样量：10μl。
3.3 标准曲线的制备
取苜蓿素标准品0.1mg，加入10ml乙腈，振荡混合，离心，取上清液2ml，即为标准品液。取不同浓度的标准品液，分别进行测定，得到峰面积与浓度的标准曲线。
3.4 样品的测定
取待测样品液2ml，进行测定，得到峰面积，根据标准曲线计算出苜蓿素的含量。

四、结果计算
样品中苜蓿素的含量，按下式计算：
样品中苜蓿素的含量（mg/g）=（样品中苜蓿素的峰面积/标准曲线中苜蓿素的峰面积）×标准品中苜蓿素的质量/样品中取样量。

五、质量控制
5.1 空白对照
取同样的操作步骤，但不加入样品，进行测定，得到峰面积，若峰面积小于检测限，则认为本次测定有效。
5.2 精密度
取同一批样品，按照本标准进行测定，计算相对标准偏差（RSD），RSD不应大于2.0%。
5.3 准确度
取不同浓度的标准品液，按照本标准进行测定，计算回收率，回收率应在95.0%~105.0%之间。

相关标准：
GB/T 5492-2008 中药材质量控制标准
DB45/T 1176-2015 山银花中蒲公英的测定 高效液相色谱法
DB45/T 1178-2015 山银花中金鸡菊的测定 高效液相色谱法
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