一、范围
本标准适用于混合型饲料添加剂中雌二醇的测定。

二、引用标准
GB/T 601-2002 分析化学通用操作方法
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范
GB/T 21932-2008 混合型饲料添加剂

三、仪器设备
1. 高效液相色谱仪
2. 色谱柱：C18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm
3. 进样器：自动进样器
4. 检测器：紫外检测器
5. 称量器：精密电子天平
6. 超声波清洗器

四、试剂和材料
1. 雌二醇标准品
2. 甲醇：色谱纯
3. 磷酸二氢钾：分析纯
4. 乙腈：色谱纯
5. 纯水：电子级

五、样品处理
1. 取样：混合型饲料添加剂样品应当按照GB/T 21932-2008的规定进行取样。
2. 样品制备：取样品1g，加入50mL甲醇中，超声波清洗10min，离心5min，取上清液过滤，取10mL过滤液，加入10mL乙腈，振荡均匀，离心5min，取上清液过滤，即为样品溶液。

六、操作步骤
1. 色谱条件
流动相：甲醇-0.05%磷酸二氢钾水溶液（70:30）
流速：1.0mL/min
检测波长：280nm
柱温：30℃
进样量：20μL
2. 标准曲线制备
取雌二醇标准品0.1mg/mL的甲醇溶液，分别取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，加入10mL乙腈中，振荡均匀，离心5min，取上清液过滤，即为标准曲线的6个浓度点。
3. 样品测定
取样品溶液20μL进样，按照色谱条件进行测定。
4. 数据处理
根据标准曲线计算样品中雌二醇的含量。

七、结果表示
样品中雌二醇的含量，以mg/kg表示。

八、精密度和准确度
1. 精密度：同一样品进行6次测定，相对标准偏差不大于5%。
2. 准确度：加标回收率在90%~110%之间。

九、质量控制
1. 标准曲线应当每天重新制备。
2. 每批样品应当设置空白样品和质控样品。

相关标准
GB/T 21932-2008 混合型饲料添加剂
GB/T 601-2002 分析化学通用操作方法
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范
GB/T 20378-2006 饲料中添加剂的检验
GB/T 20379-2006 饲料中添加剂的使用