池塘底泥是水产养殖中的重要环境因素，其中可能存在着一些有害物质，如孔雀石绿等。孔雀石绿是一种广泛应用于水产养殖中的抗菌药物，但其残留会对水产养殖产生不良影响，因此需要对其残留量进行检测。本标准采用高效液相色谱法对池塘底泥中孔雀石绿残留量进行测定。

1. 原理
将样品中的孔雀石绿提取出来，经过净化处理后，采用高效液相色谱法进行分离和检测。

2. 仪器和设备
（1）高效液相色谱仪
（2）色谱柱：C18色谱柱
（3）电子天平
（4）超声波清洗器
（5）离心机
（6）移液器
（7）pH计

3. 试剂和材料
（1）乙腈
（2）甲醇
（3）乙酸
（4）硫酸
（5）氢氧化钠
（6）硝酸钠
（7）孔雀石绿标准品

4. 操作步骤
（1）样品的制备：取适量的池塘底泥样品，加入适量的水，搅拌均匀，离心沉淀，取上清液备用。
（2）提取孔雀石绿：取上清液10 mL，加入乙腈10 mL，超声处理10 min，离心沉淀，取上清液备用。
（3）净化处理：将上清液加入C18色谱柱中，用甲醇-水（70:30）洗脱，收集洗脱液，浓缩至干燥，加入乙酸-水（1:1）溶解，调节pH至7.0左右。
（4）高效液相色谱检测：将样品注入高效液相色谱仪中，采用C18色谱柱进行分离，检测波长为630 nm。

5. 结果计算
（1）孔雀石绿标准曲线的绘制：取不同浓度的孔雀石绿标准品，按照上述方法进行提取和净化处理，测定其峰面积，绘制孔雀石绿标准曲线。
（2）样品中孔雀石绿的浓度计算：按照上述方法进行提取和净化处理，测定其峰面积，根据孔雀石绿标准曲线计算其浓度。

相关标准
GB/T 5009.199-2017 食品中孔雀石绿的测定 液相色谱法
GB/T 23533-2009 水质 水中孔雀石绿的测定 高效液相色谱法
GB/T 23534-2009 水质 水中孔雀石绿的测定 液相色谱-串联质谱法
GB/T 23535-2009 水质 水中孔雀石绿的测定 液相色谱-紫外检测法
GB/T 23536-2009 水质 水中孔雀石绿的测定 液相色谱-荧光检测法