猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是一种高度传染性的病毒，能引起猪的急性肠炎，严重影响猪的生长发育和养殖业的经济效益。因此，对PEDV的检测具有重要意义。本标准介绍了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法。

1. 试剂和设备
1.1 试剂
1.1.1 PEDV抗原
1.1.2 碳酸氢钠缓冲液
1.1.3 0.05mol/L磷酸盐缓冲液
1.1.4 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液
1.1.5 0.05mol/L PBS缓冲液
1.1.6 1%牛血清白蛋白（BSA）溶液
1.1.7 0.05%Tween-20溶液
1.1.8 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物液
1.1.9 2mol/L硫酸
1.1.10 1mol/L盐酸
1.1.11 1mol/L氢氧化钠
1.1.12 乙醇
1.1.13 甲醛
1.1.14 无菌去离子水
1.2 设备
1.2.1 微孔板洗涤器
1.2.2 微孔板振荡器
1.2.3 微孔板读板器
1.2.4 恒温水浴
1.2.5 离心机
1.2.6 恒温培养箱
1.2.7 称量器
1.2.8 滴定管
1.2.9 洗瓶
1.2.10 移液器

2. 操作步骤
2.1 制备PEDV抗原
将PEDV分离株接种于Vero细胞中，培养至细胞病变后，离心收集细胞上清液，经过梯度离心纯化后，用PBS缓冲液稀释至1:1000，作为PEDV抗原。
2.2 制备抗原包被液
将PEDV抗原用碳酸氢钠缓冲液稀释至1μg/mL，加入96孔微孔板中，4℃过夜包被。
2.3 血清稀释液的制备
将血清样品用PBS缓冲液稀释至1:100，作为血清稀释液。
2.4 ELISA检测
将包被液倒出，用1%BSA溶液洗板3次，每次洗涤5min，倒出，用0.05%Tween-20溶液洗板3次，每次洗涤5min，倒出，加入100μL血清稀释液，37℃孵育1h，洗板3次，每次洗涤5min，加入100μL稀释后的HRP标记的兔抗猪IgA二抗，37℃孵育1h，洗板3次，每次洗涤5min，加入100μL TMB底物液，37℃孵育15min，加入50μL 2mol/L硫酸停止反应，用微孔板读板器在450nm处测定吸光度值。

3. 结果判定
3.1 样品的OD值减去空白对照的OD值，得到净OD值。
3.2 根据净OD值，绘制标准曲线，计算样品的抗体滴度。
3.3 根据抗体滴度，判定样品是否为PEDV IgA抗体阳性。

相关标准
GB/T 22470-2008 猪流行性腹泻病毒检测方法
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