一、范围
本标准规定了饲料中盐酸克伦特罗的测定方法，适用于饲料中盐酸克伦特罗的测定。

二、引用标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范及评价标准
GB/T 6688-2008 分析化学实验室安全规程
GB/T 8170-2008 数值舍入规则及其在计算中的应用
GB/T 21930-2008 饲料中兽药残留量的测定 高效液相色谱法
GB/T 23533-2009 饲料中兽药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

三、试剂和仪器设备
3.1 试剂
（1）盐酸克伦特罗标准品：纯度≥98%。
（2）克伦特罗-牛血清白蛋白（KLH）偶联物：含量为1mg/mL，pH值为7.4。
（3）胶体金溶液：直径为20nm，浓度为0.01%。
（4）PBS缓冲液：PH值为7.4，含有0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的氯化钠。
（5）Tween-20：纯度≥99%。
（6）硫酸：纯度≥98%。
（7）氯化钠：纯度≥99%。
（8）乙醇：纯度≥99%。
（9）蒸馏水：用于制备试剂和洗涤。
3.2 仪器设备
（1）分光光度计：可测量450nm波长。
（2）离心机：用于离心样品。
（3）微量移液器：用于精确移液。
（4）超滤管：分子量截止值为10kDa。
（5）微孔板：96孔。

四、样品处理
4.1 样品的准备
将样品称取1g，加入50mL的PBS缓冲液中，振荡混合5min，离心10min，取上清液过滤，取上清液作为样品。

五、操作步骤
5.1 标准曲线的制备
（1）取盐酸克伦特罗标准品0.1mL，加入1.9mL的PBS缓冲液中，得到盐酸克伦特罗的1μg/mL的标准溶液。
（2）取1μg/mL的盐酸克伦特罗标准溶液0.1mL，加入1.9mL的PBS缓冲液中，得到盐酸克伦特罗的0.1μg/mL的标准溶液。
（3）依次取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL的0.1μg/mL的盐酸克伦特罗标准溶液，加入1.9mL的PBS缓冲液中，得到盐酸克伦特罗的0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1μg/mL的标准溶液。
（4）将标准溶液加入微孔板中，每个浓度加入3个孔，每个孔加入50μL的克伦特罗-牛血清白蛋白（KLH）偶联物，振荡混合2h，离心10min，弃去上清液，加入50μL的胶体金溶液，振荡混合30min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的PBS缓冲液，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的Tween-20，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的蒸馏水，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的硫酸，振荡混合5min，离心10min，测量吸光度值。
5.2 样品的测定
（1）将样品加入微孔板中，每个样品加入3个孔，每个孔加入50μL的克伦特罗-牛血清白蛋白（KLH）偶联物，振荡混合2h，离心10min，弃去上清液，加入50μL的胶体金溶液，振荡混合30min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的PBS缓冲液，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的Tween-20，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的蒸馏水，振荡混合5min，离心10min，弃去上清液，加入50μL的硫酸，振荡混合5min，离心10min，测量吸光度值。
（2）将样品的吸光度值代入标准曲线中计算盐酸克伦特罗的含量。

六、计算
6.1 标准曲线的绘制
将标准溶液的吸光度值绘制成曲线，以吸光度值为纵坐标，盐酸克伦特罗的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
6.2 样品的计算
将样品的吸光度值代入标准曲线中计算盐酸克伦特罗的含量。

七、质量控制
7.1 空白对照
在操作过程中，应设置空白对照，用PBS缓冲液代替样品进行操作，测量吸光度值，以确定胶体金免疫层析法的背景吸光度值。
7.2 精密度和重复性
在同一实验室内，重复进行5次测定，计算相对标准偏差（RSD），RSD不应大于10%。
7.3 准确度
在同一实验室内，进行3次测定，计算平均值，与已知浓度的标准品进行比较，误差不应大于10%。

相关标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范及评价标准
GB/T 6688-2008 分析化学实验室安全规程
GB/T 21930-2008 饲料中兽药残留量的测定 高效液相色谱法
GB/T 23533-2009 饲料中兽药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
GB/T 20394-2006 饲料中兽药残留量的测定 气相色谱法