叶酸是一种重要的维生素，对动物的生长发育和健康具有重要作用。饲料中叶酸的含量是衡量饲料质量的重要指标之一。本标准采用高效液相色谱法进行测定，具有准确、快速、灵敏度高等优点。

1. 原理
样品经提取后，经过色谱柱分离，利用高效液相色谱法进行检测。叶酸在特定条件下与荧光素-9-酮（F9K）反应生成荧光产物，荧光强度与叶酸的浓度成正比关系。

2. 仪器和设备
（1）高效液相色谱仪
（2）荧光检测器
（3）色谱柱：C18色谱柱
（4）移液器、量筒、瓶塞等

3. 试剂和材料
（1）甲醇
（2）乙腈
（3）磷酸二氢钾
（4）荧光素-9-酮（F9K）
（5）叶酸标准品
（6）饲料样品

4. 操作步骤
（1）样品制备：取适量饲料样品，粉碎后称取1g，加入10mL甲醇，超声提取30min，离心10min，取上清液过滤，取1mL过滤液加入10mL乙腈中，振荡混合，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。
（2）色谱条件：
流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（30:70）
流速：1.0mL/min
柱温：25℃
检测波长：λex=280nm，λem=370nm
（3）标准曲线制备：取叶酸标准品，分别加入适量甲醇中制备不同浓度的叶酸标准溶液，用同样的方法进行提取和检测，绘制标准曲线。
（4）样品检测：取待测样品，用同样的方法进行提取和检测，根据标准曲线计算叶酸含量。

5. 结果计算
样品中叶酸的含量，按下式计算：
C=（A-B）/a×V/m
其中，C为叶酸含量（μg/g），A为待测样品的荧光强度，B为空白样品的荧光强度，a为标准曲线的斜率，V为提取液的总体积（mL），m为样品的质量（g）。

相关标准
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