棉花是我国重要的经济作物之一，品种繁多，品种真实性鉴定对于棉花品种的保护和推广具有重要意义。SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记法是一种基于PCR扩增和电泳分析的分子生物学技术，具有高度的多态性和稳定性，被广泛应用于植物品种鉴定和遗传多样性分析。本标准以SSR分子标记法为基础，制定了棉花品种真实性鉴定的技术规范。

1. 适用范围
本标准适用于棉花品种真实性鉴定和遗传多样性分析。

2. 样品采集
2.1 样品选择
选择生长健壮、无病虫害的棉花植株，采集新鲜叶片或嫩芽，避免采集老化、病变或死亡的组织。
2.2 样品保存
将采集的样品放入干燥的密闭袋中，标注样品编号、采集时间和采集地点等信息，冷藏保存或立即送至实验室进行处理。

3. DNA提取
3.1 样品处理
将采集的样品用无菌水清洗干净，去除表面水分，切成小块，放入2mL离心管中。
3.2 DNA提取
按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取样品中的总DNA，质量检测后储存于-20℃冰箱中备用。

4. PCR扩增
4.1 引物设计
根据棉花基因组序列，设计适合棉花的SSR引物，引物序列应具有高度的多态性和特异性。
4.2 PCR反应体系
按照PCR试剂盒说明书进行操作，反应体系如下表所示：

| 成分 | 体积/质量 |
| --- | --- |
| 模板DNA | 50ng |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5μL |
| 2.5mM dNTPs混合液 | 0.5μL |
| 引物1 | 0.5μL |
| 引物2 | 0.5μL |
| Taq DNA聚合酶 | 0.25μL |
| ddH2O | 至25μL |

4.3 PCR反应条件
按照PCR试剂盒说明书进行操作，反应条件如下表所示：

| 步骤 | 温度 | 时间 |
| --- | --- | --- |
| 初始变性 | 94℃ | 5min |
| 循环扩增 | 94℃ | 30s |
| | 引物退火温度 | 30s |
| | 72℃ | 30s |
| 最终延伸 | 72℃ | 10min |
| 保温 | 4℃ | ∞ |

4.4 PCR产物检测
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，观察PCR产物的大小和数量，判断PCR反应是否成功。

5. 电泳分析
将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和数量，判断样品的遗传多样性和品种真实性。

相关标准
GB/T 20481-2006 棉花品种鉴定技术规范
NY/T 2633-2014 棉花品种真实性鉴定 SNP分子标记法
NY/T 2635-2014 棉花品种真实性鉴定 EST-SSR分子标记法
NY/T 2636-2014 棉花品种真实性鉴定 ISSR分子标记法
NY/T 2637-2014 棉花品种真实性鉴定 RAPD分子标记法