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饲料中罗丹明B和罗丹明6G是一种常见的饲料添加剂，但是过量使用会对动物健康产生不良影响。因此，对饲料中罗丹明B和罗丹明6G的含量进行测定具有重要意义。本标准采用高效液相色谱法测定饲料中罗丹明B和罗丹明6G的含量。

1.范围
本标准适用于饲料中罗丹明B和罗丹明6G的测定。

2.仪器和设备
2.1 高效液相色谱仪
2.2 色谱柱：C18色谱柱
2.3 称量仪
2.4 超声波清洗仪
2.5 恒温振荡器
2.6 离心机

3.试剂和材料
3.1 罗丹明B和罗丹明6G标准品
3.2 甲醇
3.3 磷酸二氢钾
3.4 乙腈
3.5 纯水

4.操作步骤
4.1 样品制备
取适量饲料样品，粉碎并过筛，称取0.5g样品，加入50ml甲醇中，超声波清洗10min，离心10min，取上清液过滤，取10ml上清液加入50ml离子交换水中，恒温振荡30min，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。

4.2 标准曲线制备
取罗丹明B和罗丹明6G标准品各适量，加入50ml甲醇中，超声波清洗10min，离心10min，取上清液过滤，取10ml上清液加入50ml离子交换水中，恒温振荡30min，离心10min，取上清液过滤，即为标准曲线。

4.3 色谱条件
色谱柱：C18色谱柱
流动相：甲醇-磷酸二氢钾缓冲液（pH=3.0）（30:70）
流速：1.0ml/min
检测波长：530nm
柱温：25℃

4.4 样品测定
取待测样品10ml，加入50ml乙腈中，超声波清洗10min，离心10min，取上清液过滤，取1ml上清液加入10ml离子交换水中，恒温振荡30min，离心10min，取上清液过滤，取1ml上清液注入色谱仪中，记录峰面积，根据标准曲线计算样品中罗丹明B和罗丹明6G的含量。

5.结果计算
样品中罗丹明B和罗丹明6G的含量，按下式计算：
C=（As/A标准）×C标准
其中，C为样品中罗丹明B和罗丹明6G的含量（mg/kg）；
As为样品中罗丹明B和罗丹明6G的峰面积之和；
A标准为标准曲线中罗丹明B和罗丹明6G的峰面积之和；
C标准为标准曲线中罗丹明B和罗丹明6G的含量（mg/L）。

相关标准：
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范和评价标准
GB/T 5009.3-2016 食品中亚硝酸盐的测定
GB/T 5009.4-2016 食品中硝酸盐的测定
GB/T 5009.5-2016 食品中亚硝胺的测定
GB/T 5009.6-2016 食品中硝胺的测定