孔雀石绿是一种广泛应用于养殖业的抗菌药物，但其残留会对人体健康造成危害。为了保障人畜健康，需要对饲料中孔雀石绿进行检测。本标准提供了一种可靠的检测方法。

1. 原理
将饲料样品经提取、净化后，采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）进行检测。

2. 试剂和仪器
2.1 甲醇：色谱纯。
2.2 乙腈：色谱纯。
2.3 硫酸铵：分析纯。
2.4 乙酸铵：分析纯。
2.5 孔雀石绿标准品：纯度≥98%。
2.6 饲料样品。
2.7 HPLC-MS/MS仪器。

3. 操作步骤
3.1 样品制备
取饲料样品5g，加入50mL甲醇，超声提取30min，离心10min，取上清液过滤，取10mL上清液加入10mL乙腈，振荡混合，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。

3.2 标准曲线制备
取孔雀石绿标准品，加入甲醇中制备1mg/mL的孔雀石绿标准溶液，再用甲醇稀释得到不同浓度的孔雀石绿标准溶液，制备标准曲线。

3.3 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI）
离子极性：正离子模式
离子源温度：120℃
毛细管电压：3.5kV
气体流量：10L/min
碰撞能量：35eV

3.4 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18（2.1mm×50mm，1.8μm）
流动相A：0.1%乙酸铵水溶液
流动相B：甲醇
梯度洗脱程序：0-1min，5% B；1-3min，5%-95% B；3-4min，95% B；4-4.1min，95%-5% B；4.1-5min，5% B
流速：0.3mL/min
柱温：40℃

3.5 检测方法
将待测样品和标准溶液分别注入HPLC-MS/MS仪器，进行检测。根据标准曲线计算出孔雀石绿的含量。

4. 结果计算
孔雀石绿的含量（mg/kg）=（待测样品孔雀石绿峰面积/内标峰面积）×内标浓度×稀释倍数

5. 精密度和准确度
5.1 精密度：在相同条件下，重复检测6次，相对标准偏差（RSD）不大于10%。
5.2 准确度：在不同浓度下，进行回收实验，回收率在80%-120%之间。

相关标准
GB/T 5009.199-2017 食品中孔雀石绿的测定
GB/T 23533-2009 饲料中抗生素残留量的测定
GB/T 22223-2008 饲料中磺胺类药物残留量的测定
GB/T 22222-2008 饲料中四环素类药物残留量的测定
GB/T 22221-2008 饲料中氨基糖苷类药物残留量的测定