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烟酰胺是一种重要的维生素，对动物的生长发育、免疫力、繁殖能力等都有重要的影响。因此，在饲料中添加适量的烟酰胺是保证动物健康生长的重要措施之一。为了保证饲料中烟酰胺的含量符合要求，需要对饲料中烟酰胺的含量进行测定。本标准采用高效液相色谱法测定饲料中烟酰胺的含量。

1. 原理
样品经提取后，经过色谱柱分离，烟酰胺在特定条件下与荧光素酰胺反应生成荧光素，荧光素的含量与烟酰胺的含量成正比关系，通过荧光检测器检测荧光素的含量，计算出烟酰胺的含量。

2. 仪器和设备
高效液相色谱仪、荧光检测器、色谱柱、移液器、离心机、超声波清洗器等。

3. 试剂和材料
甲醇、乙腈、磷酸二氢钾、荧光素酰胺、烟酰胺标准品、饲料样品等。

4. 操作步骤
（1）样品制备：取适量饲料样品，粉碎后称取1g，加入10ml甲醇，超声波处理30min，离心10min，取上清液过滤，取1ml上清液加入10ml乙腈，超声波处理30min，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。
（2）色谱条件：色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（70:30），流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为365nm。
（3）标准曲线：取烟酰胺标准品，分别加入待测样品中，制成不同浓度的标准曲线。
（4）测定：将待测样品注入高效液相色谱仪，按照色谱条件进行分离，通过荧光检测器检测荧光素的含量，计算出烟酰胺的含量。

5. 结果计算
烟酰胺的含量（mg/kg）=（样品中烟酰胺的峰面积/标准曲线中烟酰胺的峰面积）×标准品的浓度×稀释倍数。

相关标准：
GB/T 6432-2018 饲料中烟酰胺的测定 高效液相色谱法
GB/T 6433-2018 饲料中烟酰胺的测定 紫外分光光度法
GB/T 6434-2018 饲料中烟酰胺的测定 毛细管电泳法
GB/T 6435-2018 饲料中烟酰胺的测定 气相色谱法
GB/T 6436-2018 饲料中烟酰胺的测定 液相色谱法