一、范围
本标准适用于饲料中雌二醇的测定。

二、引用标准
GB/T 6682 分析化学实验室水和气的制备纯化规范
GB/T 6688 分析化学实验室安全规程
GB/T 8170 数值舍入规则及其在计算中的应用
GB/T 15203-1994 饲料中禁用物质的检验方法
GB/T 17592-1998 饲料中添加剂的检验方法

三、原理
样品经提取、净化后，采用高效液相色谱法进行测定。

四、仪器和设备
1. 高效液相色谱仪
2. 恒温振荡器
3. 离心机
4. 电子天平
5. 称量瓶、容量瓶、移液管、滤膜等

五、试剂和材料
1. 甲醇
2. 乙腈
3. 硝酸钠
4. 氢氧化钠
5. 硫酸
6. 氯仿
7. 硅胶
8. 氨水
9. 纯水

六、操作步骤
1. 样品的制备
取样品5g，加入50mL甲醇，振荡提取30min，离心10min，取上清液过滤，取1mL上清液加入10mL乙腈中，振荡提取30min，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。
2. 标准曲线的制备
取0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的雌二醇标准溶液各1mL，加入10mL乙腈中，振荡提取30min，离心10min，取上清液过滤，即为标准曲线的各浓度点。
3. 色谱条件
色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）
流动相：甲醇-水（70:30）
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
进样量：20μL
4. 检测
将待测样品和标准曲线各浓度点进样，进行高效液相色谱分析，根据峰面积计算出样品中雌二醇的含量。

七、结果计算
样品中雌二醇的含量（mg/kg）=（样品峰面积/标准曲线斜率）×标准曲线中雌二醇的浓度×稀释倍数

八、质量控制
1. 标准曲线的制备应每次测定前制备。
2. 每个样品应进行两次测定，取平均值作为最终结果。
3. 每个批次样品应加入空白样品和质控样品进行平行测定，质控样品的测定结果应符合规定的范围。

相关标准
GB/T 6682 分析化学实验室水和气的制备纯化规范
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