一、范围
本标准适用于牛奶中氨苄青霉素残留的检测。

二、仪器和设备
1. 高效液相色谱仪（HPLC）；
2. 毛细管柱；
3. 紫外检测器；
4. 称量器；
5. 移液器；
6. 离心机；
7. 超声波清洗器。

三、试剂和材料
1. 氨苄青霉素标准品；
2. 甲醇；
3. 乙腈；
4. 磷酸二氢钾；
5. 磷酸氢二钠；
6. 水；
7. 乙酸；
8. 乙酸钠；
9. 氯仿；
10. 硫酸铵；
11. 硫酸；
12. 氢氧化钠；
13. 牛奶样品。

四、样品处理
1. 取适量牛奶样品，加入等量氯仿，振荡混合；
2. 离心分离，取上层液；
3. 加入等量硫酸铵，振荡混合；
4. 离心分离，取上层液；
5. 加入等量硫酸，振荡混合；
6. 离心分离，取上层液；
7. 加入等量氢氧化钠，振荡混合；
8. 离心分离，取上层液；
9. 加入等量乙酸，振荡混合；
10. 离心分离，取上层液；
11. 加入等量乙酸钠，振荡混合；
12. 离心分离，取上层液；
13. 加入等量乙腈，振荡混合；
14. 离心分离，取上层液；
15. 加入等量甲醇，振荡混合；
16. 离心分离，取上层液；
17. 超声波清洗，用水洗净；
18. 加入等量磷酸二氢钾，振荡混合；
19. 离心分离，取上层液；
20. 过滤，取上清液。

五、操作条件
1. 毛细管柱：C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；
2. 流动相：甲醇-水（70:30）；
3. 流速：1.0 mL/min；
4. 检测波长：254 nm；
5. 进样量：20 μL；
6. 柱温：25℃。

六、标准曲线的制备
1. 取氨苄青霉素标准品，加入甲醇制备1 mg/mL的氨苄青霉素标准溶液；
2. 取不同浓度的标准溶液，分别加入磷酸二氢钾，调节pH值至7.0；
3. 用流动相稀释至不同浓度的标准溶液。

七、检测方法
1. 用标准曲线计算样品中氨苄青霉素的含量。

八、结果的计算
样品中氨苄青霉素的含量，按下式计算：
C=（A-B）/a
其中，C为氨苄青霉素的含量（μg/mL）；
A为样品的峰面积；
B为空白的峰面积；
a为标准曲线的斜率。

九、结果的表达
样品中氨苄青霉素的含量，按下式计算：
C=（A-B）/a×V/W
其中，C为氨苄青霉素的含量（μg/kg）；
A为样品的峰面积；
B为空白的峰面积；
a为标准曲线的斜率；
V为样品的体积（mL）；
W为样品的质量（kg）。

相关标准
1. GB 5009.156-2016 食品安全国家标准 食品中氨苄青霉素残留量的测定 高效液相色谱法
2. GB/T 5009.149-2016 食品安全国家标准 食品中青霉素类药物残留量的测定 高效液相色谱法
3. NY/T 831-2004 牛奶中四环素类药物残留检测方法—高效液相色谱法
4. NY/T 830-2004 牛奶中磺胺类药物残留检测方法—高效液相色谱法
5. NY/T 828-2004 牛奶中氯霉素残留检测方法—高效液相色谱法