25-羟基维生素D3是一种重要的维生素D3代谢产物，对动物的生长发育、骨骼形成和免疫功能等方面具有重要作用。因此，对饲料中25-羟基维生素D3的测定具有重要意义。

本标准采用高效液相色谱法测定饲料中25-羟基维生素D3的含量。具体操作步骤如下：

1. 样品制备

将饲料样品粉碎并过筛，取1g样品加入50mL离子交换水中，超声处理10min，离心10min，取上清液过滤，取10mL上清液加入10mL甲醇中，超声处理10min，离心10min，取上清液过滤，即为待测样品。

2. 标准曲线制备

取25-羟基维生素D3标准品，加入甲醇中制备1μg/mL的标准溶液，再用甲醇稀释得到0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL的标准溶液，分别注入高效液相色谱仪中，建立标准曲线。

3. 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）

流动相：甲醇-水（95:5）

流速：1.0mL/min

检测波长：265nm

进样量：20μL

柱温：30℃

4. 检测

将待测样品注入高效液相色谱仪中，根据标准曲线计算出25-羟基维生素D3的含量。

相关标准
GB/T 6433-2015 饲料中维生素D3的测定
GB/T 6434-2015 饲料中维生素D2的测定
GB/T 6435-2015 饲料中维生素E的测定
GB/T 6436-2015 饲料中维生素K的测定
GB/T 6437-2015 饲料中维生素A的测定