牛传染性鼻气管炎是一种由牛传染性鼻气管炎病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过飞沫传播。该病的发病率较高，严重影响了牛的生产和养殖业的发展。因此，对该病的检测和防控具有重要意义。

PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的分子生物学检测方法，已广泛应用于病原微生物的检测和诊断。本标准规定了牛传染性鼻气管炎PCR的操作规程，以保证检测结果的准确性和可靠性。

1.样品采集
样品采集应在病牛发病后的早期进行，采集的样品包括鼻分泌物、咽拭子、气管分泌物等。采集时应注意避免污染，避免与其他样品混合。

2.DNA提取
样品采集后，应立即进行DNA提取。本标准推荐使用商用DNA提取试剂盒进行提取，也可以采用传统的酚/氯仿法进行提取。提取后的DNA应保存在-20℃以下的冰箱中，以免DNA降解。

3.PCR反应体系的配制
PCR反应体系的配制应根据实验室的具体情况进行调整。本标准推荐的PCR反应体系如下：

试剂 | 体积（μL）
---|---
2×PCR Master Mix | 12.5
引物1（10μmol/L） | 0.5
引物2（10μmol/L） | 0.5
模板DNA | 2
ddH2O | 9.5
总体积 | 25

4.PCR反应程序
PCR反应程序应根据实验室的PCR仪器进行调整。本标准推荐的PCR反应程序如下：

步骤 | 温度（℃） | 时间（min） | 循环数
---|---|---|---
预变性 | 95 | 5 | 1
变性 | 95 | 30s | 35
退火 | 55 | 30s | 35
延伸 | 72 | 30s | 35
最终延伸 | 72 | 10 | 1
保温 | 4 | ∞ | 1

5.PCR产物检测和结果判定
PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳或荧光定量PCR等方法进行检测。结果判定应根据实验室的具体情况进行调整。本标准推荐的结果判定方法如下：

- 产物长度为300bp左右，且有特异性条带出现，判定为阳性；
- 产物长度不符合要求，或无特异性条带出现，判定为阴性。

相关标准
GB/T 22470-2008 牛传染性鼻气管炎病毒抗原检测试剂盒
GB/T 22471-2008 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒
GB/T 22472-2008 牛传染性鼻气管炎病毒核酸检测试剂盒
GB/T 22473-2008 牛传染性鼻气管炎病毒灭活疫苗
GB/T 22474-2008 牛传染性鼻气管炎病毒活疫苗