玉米细菌性枯萎病是由革兰氏阴性菌Erwinia chrysanthemi引起的一种病害，主要危害玉米、高粱等作物。为了防止该病的传播和扩散，需要对种子、苗木、土壤等进行检疫鉴定。本标准提供了一种基于PCR技术的检疫鉴定方法。

1. 原理
本方法利用PCR技术扩增Erwinia chrysanthemi的16S rDNA序列，通过特异性引物和荧光探针检测扩增产物，从而确定样品中是否存在Erwinia chrysanthemi。

2. 试剂和仪器
2.1 试剂
PCR扩增试剂盒、荧光探针、引物等。
2.2 仪器
PCR扩增仪、荧光定量PCR仪等。

3. 样品处理
3.1 种子样品
将种子样品表面消毒后，取适量样品进行处理。
3.2 土壤样品
取适量土壤样品，进行样品处理。

4. PCR扩增反应
4.1 PCR反应体系
PCR反应体系如下表所示：

| 成分 | 体积/质量 |
| --- | --- |
| 模板DNA | 1 μL |
| 引物1 | 0.5 μL |
| 引物2 | 0.5 μL |
| Taq DNA聚合酶 | 0.25 μL |
| dNTP混合物 | 0.5 μL |
| MgCl2 | 1.5 μL |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5 μL |
| ddH2O | 17.25 μL |

4.2 PCR反应条件
PCR反应条件如下表所示：

| 步骤 | 温度 | 时间 |
| --- | --- | --- |
| 初始变性 | 95℃ | 5 min |
| 循环扩增 | 95℃ | 30 s |
| | 60℃ | 30 s |
| | 72℃ | 30 s |
| 终止延伸 | 72℃ | 10 min |

5. 结果分析
5.1 PCR扩增产物检测
将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，确定扩增产物大小是否符合预期。
5.2 荧光定量PCR检测
将PCR扩增产物进行荧光定量PCR检测，确定样品中Erwinia chrysanthemi的存在与否。

6. 结果判定
6.1 PCR扩增产物检测
如果扩增产物大小符合预期，则判定为阳性；否则判定为阴性。
6.2 荧光定量PCR检测
如果荧光定量PCR检测结果为阳性，则判定样品中存在Erwinia chrysanthemi；否则判定为阴性。

相关标准
GB/T 4793.1-2007 玉米种子检验方法 第1部分：常规检验方法
GB/T 4793.2-2007 玉米种子检验方法 第2部分：生物学检验方法
GB/T 4793.3-2007 玉米种子检验方法 第3部分：生理学检验方法
GB/T 4793.4-2007 玉米种子检验方法 第4部分：品种纯度检验方法
GB/T 4793.5-2007 玉米种子检验方法 第5部分：杂质检验方法