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鼠疫是一种由鼠疫耶尔森氏菌引起的急性传染病，对人类和动物都有很大的危害。入出境动物皮张是鼠疫的传播途径之一，因此对其进行快速检测具有重要意义。本标准旨在规定入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌的快速检测方法。

1.范围
本标准适用于入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。

2.检测原理
本方法采用PCR技术，通过特异性引物扩增鼠疫耶尔森氏菌的16S rRNA基因，再通过荧光探针检测扩增产物，最终确定样品中是否存在鼠疫耶尔森氏菌。

3.仪器和试剂
3.1 PCR仪
3.2 PCR试剂盒
3.3 DNA提取试剂盒
3.4 离心机
3.5 紫外分光光度计

4.样品采集和处理
4.1 样品采集
采集入出境动物皮张样品，避免污染和交叉感染。
4.2 样品处理
将样品切成小块，加入适量的PBS缓冲液，用离心机离心，去除上清液，重复2次。最后将样品离心，去除上清液，留下沉淀。

5. DNA提取
将样品沉淀加入DNA提取试剂盒中，按照说明书提取DNA。

6. PCR扩增
6.1 PCR反应体系
PCR反应体系如下表所示：

试剂名称 体积/重量
PCR Mix 12.5 μL
DNA模板 2 μL
引物1 0.5 μL
引物2 0.5 μL
ddH2O 9.5 μL
总体积 25 μL

6.2 PCR反应条件
PCR反应条件如下表所示：

步骤 温度 时间
预变性 95℃ 5 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
延伸 72℃ 30 s
循环 35次
最终延伸 72℃ 10 min
保存 4℃

7.结果判定
7.1 扩增曲线
扩增曲线应呈S型，且荧光信号明显。
7.2 结果判定
若扩增曲线呈S型，荧光信号明显，且Ct值小于35，则判定为阳性；否则判定为阴性。

8.质量控制
8.1 试剂质量控制
使用PCR试剂盒和DNA提取试剂盒时，应检查试剂的质量，确保试剂的纯度和活性。
8.2 实验质量控制
在实验过程中，应设置阴性对照和阳性对照，确保实验结果的准确性和可靠性。

相关标准：
GB/T 4789.3-2016 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
GB/T 4789.4-2016 食品微生物学检验 肠道致病菌检验
GB/T 4789.5-2016 食品微生物学检验 耐热性大肠杆菌检验
GB/T 4789.10-2016 食品微生物学检验 霉菌和酵母菌总数检验
GB/T 4789.11-2016 食品微生物学检验 霉菌和酵母菌种类和数量的测定