苹果壳色单隔孢溃疡病菌是一种危害苹果树的病原菌，能引起苹果树的溃疡病。为了保护苹果树的健康，需要对苹果壳色单隔孢溃疡病菌进行检疫鉴定。本标准规定了苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法，包括生物学特性、分离鉴定和PCR检测等内容。

1 生物学特性
1.1 形态特征
苹果壳色单隔孢溃疡病菌是一种革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，大小为0.5-0.8×1.0-2.0μm，有单个鞭毛。在营养琼脂平板上生长，菌落呈灰白色，表面光滑，边缘整齐，直径为1-2mm。

1.2 生理生化特性
苹果壳色单隔孢溃疡病菌是一种嗜寒菌，最适生长温度为20℃，最低生长温度为4℃。在营养琼脂平板上生长，能产生黄色色素。能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖酸、琥珀酸、柠檬酸等为唯一碳源生长。

2 分离鉴定
2.1 样品采集
从疑似感染苹果壳色单隔孢溃疡病菌的苹果果实、叶片、枝条等部位采集样品。样品应在采集后立即送至实验室进行处理。

2.2 分离培养
将样品表面消毒后，取适量样品切碎，加入适量的生理盐水中，振荡均匀后进行稀释。将稀释液均匀涂布于营养琼脂平板上，放置于20℃恒温箱中培养3-5天。

2.3 鉴定
在营养琼脂平板上生长的菌落进行形态学观察和生理生化试验，如革兰染色、氧化酶试验、卡氏染色、甲基红-Voges-Proskauer试验等，以确定是否为苹果壳色单隔孢溃疡病菌。

3 PCR检测
3.1 样品处理
将样品表面消毒后，取适量样品切碎，加入适量的生理盐水中，振荡均匀后进行稀释。

3.2 DNA提取
采用DNA提取试剂盒提取样品中的总DNA。

3.3 PCR扩增
采用特异性引物对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的16S rRNA基因进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环。

3.4 PCR产物检测
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物是否为目标片段。

相关标准
GB/T 4793.1-2007 植物检疫技术通则
GB/T 4793.2-2007 植物检疫技术 有害生物检疫鉴定通则
GB/T 4793.3-2007 植物检疫技术 植物病原菌检疫鉴定通则
GB/T 4793.4-2007 植物检疫技术 昆虫检疫鉴定通则
GB/T 4793.5-2007 植物检疫技术 线虫检疫鉴定通则