咖啡浆果炭疽病菌是一种危害咖啡生产的病原菌，能够引起咖啡浆果的腐烂，严重影响咖啡的产量和质量。为了保障咖啡生产的安全和质量，需要对咖啡浆果炭疽病菌进行检疫鉴定。本标准就是为了规范咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法而制定的。

1 范围
本标准适用于咖啡浆果炭疽病菌的检疫鉴定。

2 试验设备和试剂
2.1 试验设备
2.1.1 培养箱
2.1.2 显微镜
2.1.3 灭菌器
2.1.4 称量器
2.1.5 均质器
2.1.6 恒温水浴器
2.1.7 离心机
2.1.8 恒温培养箱
2.1.9 无菌操作台
2.1.10 无菌培养皿
2.1.11 玻璃棒
2.1.12 移液器
2.1.13 滤纸
2.1.14 纱布
2.1.15 烧杯
2.1.16 试管
2.1.17 塑料袋
2.1.18 洗涤器
2.1.19 洗涤皿
2.1.20 热板

2.2 试剂
2.2.1 碳酸钠
2.2.2 氯化钠
2.2.3 硝酸钠
2.2.4 硫酸
2.2.5 无水乙醇
2.2.6 无菌蒸馏水
2.2.7 洗涤剂
2.2.8 琼脂
2.2.9 氯仿
2.2.10 甲醇
2.2.11 乙醇
2.2.12 氯仿-甲醇（1:1）

3 样品采集和处理
3.1 样品采集
3.1.1 采集咖啡浆果样品，应选择病情明显、病斑较大、病斑边缘清晰的浆果。
3.1.2 采集样品时，应避免样品受到污染和损伤。
3.1.3 采集的样品应立即送至实验室进行处理。

3.2 样品处理
3.2.1 将采集的样品放入无菌烧杯中，用无菌蒸馏水洗涤3次，每次洗涤时间不少于1分钟。
3.2.2 将样品表面的水分吸干，用无菌玻璃棒将样品表面的病斑刮下，刮下的病斑放入无菌离心管中。
3.2.3 将离心管中的样品加入2ml无菌蒸馏水，用均质器均匀悬浮，制备样品悬浮液。

4 分离和鉴定
4.1 分离
4.1.1 取适量样品悬浮液，分别接种于琼脂平板上，用无菌棉签均匀涂抹。
4.1.2 将琼脂平板放入恒温培养箱中，温度为25℃，培养时间为3-5天。
4.1.3 观察琼脂平板上是否有菌落生长，如有，则进行鉴定。

4.2 鉴定
4.2.1 取菌落，用无菌移液器将菌落转移到无菌玻璃片上，加入一滴无菌蒸馏水，用显微镜观察菌落形态和结构。
4.2.2 取菌落，用无菌移液器将菌落转移到无菌琼脂平板上，进行纯化培养。
4.2.3 进行生理生化鉴定，包括氧化酶试验、嫌氧培养试验、酸碱反应试验等。
4.2.4 进行分子生物学鉴定，包括PCR扩增、DNA测序等。

相关标准
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