杏褪绿卷叶植原体是一种危害果树的病原体，能够引起杏、樱桃、李等果树的卷叶、萎蔫、枯死等症状，对果树生长发育和产量造成严重影响。为了防止该病原体的传播和扩散，需要对进出口果树及其种苗进行检疫鉴定。本标准旨在规范杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法，保障果树生产的健康发展。

1 范围
本标准适用于杏褪绿卷叶植原体的检疫鉴定。

2 规定
2.1 样品采集
2.1.1 样品采集时间
应在果树生长期内采集样品，以病株为主，同时采集健康株作为对照。
2.1.2 样品采集方法
采用无菌操作，将病株叶片、茎、根等部位分别采集，每个部位采集3-5个样品，放入无菌袋中，密封后放入冰箱保存，送检前应在4℃下保存不超过48小时。
2.2 样品处理
2.2.1 样品处理方法
将样品取出，去除杂质，将叶片、茎、根等部位分别切成小块，加入液氮中研磨成粉末，取1g左右的粉末加入2mL的提取液中，振荡混合，放置室温下静置10min，离心5min，取上清液备用。
2.2.2 提取液配制
取Tris-HCl缓冲液10mL，加入Tween-20 0.1mL，混合均匀，加入SDS 0.5g，混合均匀，加入EDTA 0.1g，混合均匀，加入蛋白酶K 0.1g，混合均匀，调节pH至8.0，加入蒸馏水至20mL，混合均匀，过滤灭菌备用。
2.3 PCR扩增
2.3.1 PCR扩增体系
PCR反应体系总体积为25μL，包括模板DNA 2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs混合液0.5μL，MgCl2 1.5μL，引物1μL，Taq酶0.25μL，蒸馏水17.25μL。
2.3.2 引物设计
根据杏褪绿卷叶植原体的16S rDNA序列设计引物，引物序列如下：
Forward primer: 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
Reverse primer: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.3.3 PCR扩增条件
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
2.4 PCR产物检测
2.4.1 PCR产物检测方法
将PCR产物取2μL，加入1%琼脂糖凝胶中，电泳检测，预处理琼脂糖凝胶，电泳条件为：电压120V，电流200mA，电泳时间30min，用紫外线照射，观察PCR产物条带是否出现。

相关标准
GB/T 31938-2015 植物检疫技术术语
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