一、范围
本标准适用于水生动物及其产品中乙烯雌酚、甲孕酮的液相芯片检验。

二、引用标准
GB/T 6682 分析化学实验室用水规格
GB/T 6688 分析化学实验室技术要求和管理规范
GB/T 20394 液相色谱-质谱联用术语和定义
GB/T 20395 液相色谱-质谱联用方法的验证
GB/T 20396 液相色谱-质谱联用方法的应用

三、术语和定义
本标准所涉及的术语和定义见GB/T 20394。

四、原理
样品经提取、净化后，采用液相色谱-质谱联用技术，利用电喷雾离子源（ESI）进行离子化，采用多反应监测（MRM）模式进行定量分析。

五、试剂和材料
5.1 甲醇（色谱纯）
5.2 乙腈（色谱纯）
5.3 离子交换柱
5.4 固相萃取柱
5.5 乙烯雌酚、甲孕酮标准品

六、仪器设备
6.1 液相色谱-质谱联用仪
6.2 电喷雾离子源（ESI）
6.3 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）

七、分析步骤
7.1 样品制备
7.1.1 取适量样品，加入甲醇，超声提取，离心，取上清液。
7.1.2 取上清液，加入固相萃取柱，洗脱，收集洗脱液。
7.1.3 取洗脱液，加入离子交换柱，洗脱，收集洗脱液。
7.1.4 取洗脱液，加入乙腈，稀释，混匀，离心，取上清液。

7.2 液相色谱-质谱联用分析
7.2.1 仪器条件
柱：Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）
流动相A：0.1%甲酸水溶液
流动相B：乙腈
梯度程序：0-1.5 min，5% B；1.5-3.5 min，5%-95% B；3.5-4.5 min，95% B；4.5-4.6 min，95%-5% B；4.6-6.0 min，5% B
流速：0.3 mL/min
柱温：40℃
进样量：5 μL
离子源温度：120℃
毛细管电压：3.5 kV
气体流量：10 L/min
气体温度：350℃
MRM参数：见表1

表1 MRM参数

化合物名 量子数（m/z） 离子源参数 MRM参数

乙烯雌酚 271.2/225.1 ESI+ 35 V CE 20 eV
甲孕酮 315.2/271.2 ESI+ 35 V CE 20 eV

7.2.2 定量方法
采用外标法定量，以乙烯雌酚、甲孕酮标准品为外标，建立标准曲线，计算样品中乙烯雌酚、甲孕酮的含量。

八、质量控制
8.1 样品加标回收率
在样品中加入一定量的乙烯雌酚、甲孕酮标准品，进行提取、净化、分析，计算加标回收率。

8.2 方法检出限
乙烯雌酚、甲孕酮的方法检出限分别为0.5 μg/kg。

九、结果计算与报告
9.1 计算
乙烯雌酚、甲孕酮的含量计算公式见式（1）。

式（1）：C=（A-B）/a×V/m
式中：
C——乙烯雌酚、甲孕酮的含量，μg/kg；
A——样品中乙烯雌酚、甲孕酮的峰面积；
B——空白样品中乙烯雌酚、甲孕酮的峰面积；
a——乙烯雌酚、甲孕酮标准品的质量浓度，μg/mL；
V——样品提取液的体积，mL；
m——样品的质量，kg。

9.2 报告
检验报告中应包括以下内容：
a) 样品名称、编号、来源、采样日期、检验日期；
b) 分析项目、方法、结果；
c) 分析人员、审核人员、批准人员的签名。

十、检验结果的判定
10.1 检验结果的判定应符合GB/T 6682的规定。
10.2 检验结果的判定应符合GB/T 6688的规定。

相关标准
GB/T 6682 分析化学实验室用水规格
GB/T 6688 分析化学实验室技术要求和管理规范
GB/T 20394 液相色谱-质谱联用术语和定义
GB/T 20395 液相色谱-质谱联用方法的验证
GB/T 20396 液相色谱-质谱联用方法的应用