霍乱是一种由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，具有高度传染性和致死性。为了保障国境口岸的食品安全和公共卫生，需要对进出口的水源、食品、环境等样品进行霍乱弧菌和霍乱肠毒素的检测。本标准旨在规定国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法。

1.范围
本标准适用于国境口岸水源、食品、环境等样品中霍乱弧菌和霍乱肠毒素的检测。

2.引用标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质实验室基本要求
GB/T 191-2008 包装、装运、储存标志和说明文件的编制
GB/T 2828.1-2012 采样检验程序第1部分：按计划采样程序
GB/T 2829-2002 采样检验程序第2部分：抽样程序
GB/T 17626.2-2006 电磁兼容性（EMC）试验 第2部分：环境试验

3.术语和定义
3.1 霍乱弧菌
霍乱弧菌是一种革兰氏阴性弧菌，是引起霍乱的病原体。

3.2 霍乱肠毒素
霍乱肠毒素是霍乱弧菌分泌的一种毒素，是引起霍乱的主要原因。

3.3 实时PCR
实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）是一种快速、灵敏、特异、定量的核酸检测技术。

4.原理
本标准采用实时PCR技术，利用霍乱弧菌和霍乱肠毒素的特异性基因序列进行检测。

5.试剂和材料
5.1 试剂
PCR扩增试剂盒、DNA提取试剂盒、PCR扩增酶、引物、探针等。

5.2 材料
PCR仪、离心管、PCR板、移液器、显微镜等。

6.操作步骤
6.1 样品采集和处理
按照GB/T 2828.1-2012和GB/T 2829-2002的要求采集样品，并按照GB/T 6682-2008的要求进行处理。

6.2 DNA提取
按照DNA提取试剂盒的说明书进行提取。

6.3 PCR扩增
按照PCR扩增试剂盒的说明书进行扩增。

6.4 结果分析
利用PCR仪进行扩增曲线分析，根据阈值周期数（Ct值）判断样品中是否存在霍乱弧菌和霍乱肠毒素。

7.结果判定
7.1 霍乱弧菌检测
当样品中存在霍乱弧菌时，扩增曲线呈S型，Ct值小于等于35。

7.2 霍乱肠毒素检测
当样品中存在霍乱肠毒素时，扩增曲线呈S型，Ct值小于等于35。

8.质量控制
8.1 试剂和材料的质量控制
试剂和材料应符合相关标准的要求。

8.2 实验室质量控制
实验室应符合GB/T 6682-2008的要求。

9.报告
报告应包括样品信息、检测结果、分析方法、检测时间等内容。

相关标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质实验室基本要求
GB/T 191-2008 包装、装运、储存标志和说明文件的编制
GB/T 2828.1-2012 采样检验程序第1部分：按计划采样程序
GB/T 2829-2002 采样检验程序第2部分：抽样程序
GB/T 17626.2-2006 电磁兼容性（EMC）试验 第2部分：环境试验