油菜是我国重要的油料作物之一，也是我国传统的蔬菜作物之一。随着生物技术的发展，转基因油菜的研究和应用越来越广泛。为了保障食品安全和生态环境，对油菜中转基因成分的检测和鉴定显得尤为重要。本标准旨在规范油菜中转基因成分检测的普通PCR和实时荧光PCR方法。

1.范围
本标准适用于油菜中转基因成分的检测和鉴定。

2.引用文件
GB/T 191-2008 包装、装运、储存标志和说明文件的编制方法
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范和评价
GB/T 17215.1-2007 生物技术实验室安全 第1部分：基本要求
GB/T 19495.1-2004 分子生物学实验室安全 第1部分：基本要求

3.术语和定义
3.1 转基因
指通过人工手段将外源基因导入到接受体生物体中，使其获得新的遗传特性的生物体。

3.2 转基因成分
指转基因生物体中所含的外源基因及其表达产物。

3.3 PCR
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种体外扩增DNA的技术。

3.4 实时荧光PCR
是一种在PCR反应过程中实时检测PCR产物的技术，通过荧光信号的变化来判断PCR反应的进程和结果。

4.检测方法
4.1 普通PCR检测方法
4.1.1 样品制备
将待检样品（包括油菜种子、油菜叶片、油菜花粉等）进行样品制备，提取样品中的总DNA。

4.1.2 PCR反应
将提取的总DNA作为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，扩增条件如下：
初始变性：95℃，5min
循环反应：95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，共35个循环
最终延伸：72℃，10min
PCR反应体系如下：

试剂 配置量（μL）
2×PCR Mix 12.5
引物1 0.5
引物2 0.5
模板DNA 2
ddH2O 9.5
总量 25

4.1.3 PCR产物检测
将PCR产物进行凝胶电泳检测，判断是否存在目标基因。

4.2 实时荧光PCR检测方法
4.2.1 样品制备
将待检样品（包括油菜种子、油菜叶片、油菜花粉等）进行样品制备，提取样品中的总DNA。

4.2.2 实时荧光PCR反应
将提取的总DNA作为模板，使用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，扩增条件如下：
初始变性：95℃，5min
循环反应：95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，共40个循环
实时检测：72℃，30s
实时荧光PCR反应体系如下：

试剂 配置量（μL）
2×PCR Mix 12.5
引物1 0.5
引物2 0.5
探针 0.5
模板DNA 2
ddH2O 9
总量 25

4.2.3 实时荧光PCR产物检测
通过实时荧光PCR仪器检测PCR反应过程中荧光信号的变化，判断是否存在目标基因。

5.结果判定
5.1 普通PCR检测结果判定
如果PCR反应产物在凝胶电泳中出现目标条带，则判定为阳性；如果PCR反应产物在凝胶电泳中未出现目标条带，则判定为阴性。

5.2 实时荧光PCR检测结果判定
通过实时荧光PCR仪器检测PCR反应过程中荧光信号的变化，如果荧光信号曲线呈S型，则判定为阳性；如果荧光信号曲线呈直线，则判定为阴性。

相关标准
GB/T 28001-2011 职业健康安全管理体系规范
GB/T 28004-2011 职业健康安全管理体系指南
GB/T 28005-2011 职业健康安全管理体系评价指南
GB/T 28006-2011 职业健康安全管理体系审核指南
GB/T 28007-2011 职业健康安全管理体系术语