血清25-羟基维生素D3是评价人体维生素D营养状况的重要指标，其测定方法的准确性对于临床诊断和治疗具有重要意义。本标准采用同位素稀释液相色谱串联质谱法进行血清25-羟基维生素D3的测定。

1. 样品处理
1.1 血清样品的采集和保存
血清样品应在离心后立即分装，保存在-80℃以下的冰箱中，避免多次冻融。

1.2 样品前处理
将血清样品加入内标溶液，进行蛋白质沉淀、液液萃取和固相萃取等步骤，最终得到待测样品。

2. 仪器操作
2.1 色谱柱
采用C18反相色谱柱，柱长为50mm，内径为2.1mm，颗粒大小为3μm。

2.2 质谱仪
采用三重四极杆串联质谱仪，离子源为电喷雾离子源。

2.3 色谱条件
流动相为甲醇/水（含0.1%甲酸），梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

3. 质量控制
3.1 标准曲线
采用外标法建立标准曲线，浓度范围为0.5-100ng/mL。

3.2 质控品
采用两个浓度的质控品进行质量控制，浓度分别为10ng/mL和50ng/mL。

4. 数据处理
4.1 数据分析
采用同位素稀释法计算样品中25-羟基维生素D3的浓度。

4.2 数据报告
报告样品中25-羟基维生素D3的浓度，同时报告质控品的浓度和相对误差。

相关标准
GB/T 5009.268-2016 食品中维生素D的测定 高效液相色谱法

GB/T 22388-2008 食品中维生素D的测定 液相色谱法

GB/T 22387-2008 食品中维生素D的测定 高效液相色谱法

GB/T 22386-2008 食品中维生素D的测定 气相色谱法

GB/T 22385-2008 食品中维生素D的测定 高效液相色谱-串联质谱法