蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，广泛应用于生化试剂中。蛋白酶K的活性检测是保证生化试剂质量的重要指标之一。本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法，以保证生化试剂的质量。

1.范围
本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法。

2.试剂和仪器
2.1 试剂
（1）蛋白酶K标准品
（2）Tris-HCl缓冲液
（3）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液
（4）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100的溶液
（5）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100和0.1% BSA的溶液
（6）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA和0.1% PMSF的溶液
（7）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF和0.1% DTT的溶液
（8）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT和0.1% EDTA的溶液
（9）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA和0.1% pepstatin A的溶液
（10）pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA、0.1% pepstatin A和0.1% leupeptin的溶液

2.2 仪器
分光光度计、离心机、恒温水浴器、pH计、比色皿、移液器、吸光度计等。

3.样品的制备
将生化试剂中的蛋白酶K溶解在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，制备成1mg/mL的蛋白酶K溶液。

4.操作步骤
4.1 制备不同浓度的蛋白酶K标准品溶液，分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9μg/mL。
4.2 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.3 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.4 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100和0.1% BSA的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.5 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA和0.1% PMSF的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.6 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF和0.1% DTT的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.7 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT和0.1% EDTA的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.8 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA和0.1% pepstatin A的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.9 取0.1mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA、0.1% pepstatin A和0.1% leupeptin的溶液，混匀，作为0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液。
4.10 取0.1mL的生化试剂中的蛋白酶K溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA、0.1% pepstatin A和0.1% leupeptin的溶液，混匀，作为待测样品。

5.测定
5.1 取0.1mL的0.1μg/mL的蛋白酶K标准品溶液，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA、0.1% pepstatin A和0.1% leupeptin的溶液，混匀，作为对照组。
5.2 取0.1mL的待测样品，加入0.9mL的pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中含有0.1% Triton X-100、0.1% BSA、0.1% PMSF、0.1% DTT、0.1% EDTA、0.1% pepstatin A和0.1% leupeptin的溶液，混匀。
5.3 在37℃恒温水浴器中孵育30min。
5.4 加入0.1mL的0.1% casein溶液，混匀，孵育30min。
5.5 加入0.5mL的10% TCA溶液，混匀，离心10min。
5.6 取上清液0.5mL，加入2.5mL的0.4mol/L NaOH溶液，混匀。
5.7 在分光光度计上测定吸光度值A1。
5.8 重复以上步骤，取不同浓度的蛋白酶K标准品溶液进行测定，测定吸光度值A2。
5.9 计算蛋白酶K的活性。

6.计算
6.1 计算对照组的吸光度值A0。
6.2 计算蛋白酶K的活性。
蛋白酶K的活性（U/mg）=（A1-A0）/（A2-A0）×0.1×1000

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