一、范围
本标准适用于辣椒粉中天然着色物质总含量的测定。

二、引用标准
GB/T 601-2002 食品添加剂通用标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范及评价标准
GB/T 14675-1993 食品添加剂中铅、砷、汞、镉的测定
GB/T 22298-2008 辣椒粉 香辛料总量的测定

三、原理
将辣椒粉样品经过提取、分离、净化后，用分光光度法测定天然着色物质的吸光度，根据标准曲线计算出天然着色物质总含量。

四、仪器和设备
4.1 分光光度计：量程为400~700nm，分辨率为1nm。
4.2 恒温振荡器：温度范围为20~60℃，振幅为20~200rpm。
4.3 离心机：最高转速为5000rpm。
4.4pH计：测量范围为0~14。
4.5 电子天平：分辨率为0.0001g。

五、试剂和材料
5.1 乙醇（C2H5OH）：色谱纯。
5.2 氯仿（CHCl3）：色谱纯。
5.3 硫酸（H2SO4）：质量分数为98%。
5.4 氢氧化钠（NaOH）：质量分数为98%。
5.5 硫酸铜（CuSO4）：质量分数为5%。
5.6 硫酸铵（NH4）2SO4）：质量分数为10%。
5.7 磷酸二氢钾（KH2PO4）：质量分数为99%。
5.8 磷酸氢二钠（NaH2PO4）：质量分数为99%。
5.9 磷酸三钠（Na3PO4）：质量分数为99%。
5.10 氯化钠（NaCl）：质量分数为99%。
5.11 纯水：电阻率大于18MΩ·cm。
5.12 标准品：纯度大于98%的胡萝卜素、胡萝卜烯、类胡萝卜素等。

六、样品的制备
6.1 取样：按照GB/T 22298-2008的规定取样。
6.2 样品的制备：将样品研磨成粉末，过筛后密封保存。

七、操作步骤
7.1 标准曲线的制备
7.1.1 取胡萝卜素、胡萝卜烯、类胡萝卜素等标准品，分别称取适量，加入10ml氯仿中，摇匀，制成1mg/ml的标准溶液。
7.1.2 取1ml标准溶液，加入10ml氯仿中，摇匀，制成0.1mg/ml的标准溶液。
7.1.3 取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准溶液，加入10ml氯仿中，摇匀，制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的标准溶液。
7.1.4 用分光光度计在450nm处测定各标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。

7.2 样品的提取
7.2.1 取样品0.5g，加入50ml乙醇中，用恒温振荡器摇匀提取2h。
7.2.2 离心10min，取上清液，过滤。

7.3 样品的分离
7.3.1 取上清液5ml，加入10ml氯仿中，摇匀，离心10min。
7.3.2 取上层氯仿液，过滤。

7.4 样品的净化
7.4.1 取上层氯仿液2ml，加入10ml硫酸铜溶液中，摇匀，放置10min。
7.4.2 加入10ml硫酸铵溶液，摇匀，放置10min。
7.4.3 加入10ml氯化钠溶液，摇匀，放置10min。
7.4.4 取上层氯仿液，过滤。

7.5 样品的测定
7.5.1 取净化后的氯仿液2ml，加入10ml磷酸缓冲液中，调节pH值为7.0。
7.5.2 用分光光度计在450nm处测定吸光度。
7.5.3 根据标准曲线计算出天然着色物质总含量。

八、计算
样品中天然着色物质总含量的计算公式为：
C=As/Ak×Ck×V/D
式中：
C——天然着色物质总含量，mg/kg；
As——样品的吸光度；
Ak——标准曲线上对应吸光度的胡萝卜素、胡萝卜烯、类胡萝卜素等的总含量，mg/L；
Ck——标准曲线上对应吸光度的胡萝卜素、胡萝卜烯、类胡萝卜素等的总含量，mg/L；
V——样品提取液的总体积，ml；
D——样品的质量，g。

九、结果的表示
保留两位小数，单位为mg/kg。

十、精密度和准确度
10.1 精密度：同一实验室内，重复测定5次，相对标准偏差不大于5%。
10.2 准确度：加标回收率在90%~110%之间。

相关标准
GB/T 22298-2008 辣椒粉 香辛料总量的测定
GB/T 601-2002 食品添加剂通用标准
GB/T 6682-2008 分析化学实验室水质规范及评价标准
GB/T 14675-1993 食品添加剂中铅、砷、汞、镉的测定
GB/T 22297-2008 食品添加剂辣椒红素的测定