预混合饲料是指将各种饲料原料和添加剂按一定比例混合后，经过机械混合、加工、包装而成的一种饲料。预混合饲料中添加了d-生物素，可以提高动物的生长速度和免疫力。因此，对预混合饲料中d-生物素的测定显得尤为重要。

本标准采用高效液相色谱法测定预混合饲料中d-生物素的含量。具体操作步骤如下：

1. 样品的制备

将预混合饲料样品取1g，加入50mL的甲醇中，振荡10min，离心10min，取上清液过滤，取10mL上清液，加入10mL的水，混合均匀，即得样品溶液。

2. 标准品的制备

取d-生物素标准品1mg，加入50mL的甲醇中，振荡10min，离心10min，取上清液过滤，取10mL上清液，加入10mL的水，混合均匀，即得标准品溶液。

3. 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）

流动相：甲醇-水（75:25）

流速：1.0mL/min

检测波长：235nm

柱温：30℃

进样量：20μL

4. 操作步骤

（1）将样品溶液和标准品溶液分别进样，进行色谱分离。

（2）根据峰面积计算样品中d-生物素的含量。

5. 结果计算

样品中d-生物素的含量（mg/kg）=（样品中d-生物素的峰面积/标准品中d-生物素的峰面积）×标准品中d-生物素的质量浓度×1000/样品质量

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