维生素D3是一种脂溶性维生素，对于动物的生长发育和骨骼健康至关重要。因此，在饲料中添加适量的维生素D3是非常必要的。然而，饲料中维生素D3的含量往往很低，需要进行精确的测定。本标准采用高效液相色谱法测定饲料中维生素D3的含量，具有准确、快速、简便等优点。

1. 原理
将饲料样品中的维生素D3提取出来，经过净化和分离后，采用高效液相色谱法进行测定。测定时，使用C18反相色谱柱，以甲醇-水为流动相，检测波长为265nm。

2. 仪器和设备
（1）高效液相色谱仪
（2）色谱柱：C18反相色谱柱
（3）分光光度检测器
（4）电子天平
（5）超声波清洗器

3. 试剂和材料
（1）甲醇
（2）水
（3）氯仿
（4）饲料样品
（5）维生素D3标准品

4. 操作步骤
（1）样品制备：取适量饲料样品，粉碎后称取1g，加入10mL氯仿，超声波清洗10min，离心分离，取上清液过滤，取1mL上清液加入10mL甲醇，超声波清洗10min，离心分离，取上清液过滤，即为样品溶液。
（2）标准曲线制备：取维生素D3标准品，加入甲醇中制备不同浓度的标准溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，绘制标准曲线。
（3）样品测定：取样品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，根据标准曲线计算出维生素D3的含量。

5. 结果计算
维生素D3的含量计算公式为：C=（A-B）/a，其中C为维生素D3的含量，A为样品峰面积，B为空白峰面积，a为标准曲线斜率。

相关标准
GB/T 6433-2015 饲料中维生素D3的测定
GB/T 6434-2015 饲料中维生素D2的测定
GB/T 6435-2015 饲料中维生素A的测定
GB/T 6436-2015 饲料中维生素E的测定
GB/T 6437-2015 饲料中维生素K的测定