柑橘顽固病是一种由螺旋体科细菌引起的病害，严重危害柑橘产业。螺原体是柑橘顽固病的病原体，其检疫鉴定是柑橘顽固病防控的重要环节。本标准旨在规范柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法，提高检测准确性和可靠性。

1.范围
本标准适用于柑橘顽固病螺原体的检疫鉴定。

2.样品采集
2.1 样品采集时间
采样时间应在柑橘生长期内，以病树为主，同时采集健康树作为对照。
2.2 样品采集方法
采用无菌剪刀或无菌手术刀，将病树枝条或叶片剪下，放入无菌塑料袋中，密封后放入冰袋中运输至实验室。

3.样品处理
3.1 样品消毒
将采集的样品在实验室内进行消毒处理，消毒液为70%乙醇或0.1%次氯酸钠溶液。
3.2 样品分离
将样品分离成叶片、枝条、根系等部位，每个部位分别进行检测。

4.DNA提取
4.1 样品研磨
将样品放入液氮中研磨成粉末状。
4.2 DNA提取
采用DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取后的DNA用紫外分光光度计检测纯度和浓度。

5.PCR扩增
5.1 PCR反应体系
PCR反应体系包括模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs等。
5.2 PCR反应条件
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保持。

6.PCR产物检测
6.1 PCR产物检测方法
采用凝胶电泳法进行PCR产物检测。
6.2 PCR产物检测结果判定
PCR产物检测结果分为阳性和阴性两种，阳性表示样品中存在螺原体，阴性表示样品中不存在螺原体。

相关标准
GB/T 36844-2018 柑橘顽固病检疫鉴定方法
GB/T 36846-2018 柑橘黄龙病螺旋体检疫鉴定方法
GB/T 36847-2018 柑橘绿斑病检疫鉴定方法
GB/T 36848-2018 柑橘溃疡病检疫鉴定方法
GB/T 36849-2018 柑橘黑斑病检疫鉴定方法