猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的急性、高度接触性传染病，对猪的危害极大。为了及时发现和控制猪瘟的传播，需要对猪群进行定期检测。猪瘟抗体间接ELISA检测方法是一种常用的检测方法，本标准就是为了规范这种检测方法的操作流程和结果判定。

1. 要求
本标准适用于猪血清中猪瘟抗体的检测。

2. 试剂
2.1 酶标板：96孔酶标板。
2.2 猪瘟病毒抗原：猪瘟病毒抗原应为纯化的病毒抗原。
2.3 辅助抗体：辅助抗体应为抗豚鼠IgG的多克隆抗体。
2.4 酶标记抗体：酶标记抗体应为抗豚鼠IgG的单克隆抗体。
2.5 底物：底物应为TMB底物。

3. 仪器设备
3.1 酶标仪：可测量450nm波长的酶标仪。
3.2 洗板机：可自动洗板的洗板机。
3.3 离心机：可离心96孔酶标板的离心机。

4. 操作程序
4.1 样品处理：将待检测的猪血清标本离心去除悬浮物，然后将血清标本稀释至1:100，即取1μL血清加入99μL稀释液中。
4.2 酶标板涂覆：将猪瘟病毒抗原加入96孔酶标板中，每孔加入100μL，然后在4℃下过夜静置。
4.3 洗板：将酶标板中的液体倒出，然后用PBS洗板3次，每次洗涤200μL。
4.4 阻断：将5%的蛋白质溶液加入酶标板中，每孔加入200μL，然后在37℃下孵育1小时。
4.5 加样：将样品加入酶标板中，每孔加入100μL，然后在37℃下孵育1小时。
4.6 洗板：将酶标板中的液体倒出，然后用PBS洗板3次，每次洗涤200μL。
4.7 加辅助抗体：将辅助抗体加入酶标板中，每孔加入100μL，然后在37℃下孵育1小时。
4.8 洗板：将酶标板中的液体倒出，然后用PBS洗板3次，每次洗涤200μL。
4.9 加酶标记抗体：将酶标记抗体加入酶标板中，每孔加入100μL，然后在37℃下孵育1小时。
4.10 洗板：将酶标板中的液体倒出，然后用PBS洗板3次，每次洗涤200μL。
4.11 加底物：将TMB底物加入酶标板中，每孔加入100μL，然后在37℃下孵育15分钟。
4.12 终止反应：加入2M H2SO4终止反应，每孔加入50μL。
4.13 测量：用酶标仪在450nm波长下测量吸光度值。

5. 结果判定
5.1 样品的吸光度值应该大于或等于阴性对照的吸光度值。
5.2 样品的吸光度值与阳性对照的吸光度值比值应该大于或等于2.1。
5.3 样品的吸光度值与阳性对照的吸光度值比值应该小于或等于0.9。

6. 质量控制
6.1 阳性对照：应该使用已知含有猪瘟抗体的血清作为阳性对照。
6.2 阴性对照：应该使用未感染猪瘟病毒的血清作为阴性对照。
6.3 重复性：同一实验室内应该进行重复性检测，每个样品应该进行3次检测，吸光度值的变异系数应该小于10%。

相关标准
GB/T 35907-2018 猪瘟病毒抗原间接ELISA检测方法
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