T4 DNA连接酶是一种广泛应用于分子生物学领域的酶，主要用于DNA连接反应。为了保证T4 DNA连接酶的质量，需要对其进行酶活及杂质检测。本标准就是为了规范T4 DNA连接酶的酶活及杂质检测方法。

一、酶活检测方法
1. 原理
T4 DNA连接酶酶活检测方法采用DNA连接反应，通过测定DNA连接反应产物的数量来计算酶活。

2. 试剂和仪器
（1）T4 DNA连接酶
（2）10×T4 DNA连接酶反应缓冲液
（3）10 mM ATP
（4）10 mM MgCl2
（5）0.5 M Tris-HCl（pH 7.5）
（6）0.5 M EDTA（pH 8.0）
（7）0.5 M NaCl
（8）0.1 M DTT
（9）DNA连接底物
（10）1%琼脂糖凝胶
（11）UV照射仪

3. 操作步骤
（1）制备反应体系
将10×T4 DNA连接酶反应缓冲液、10 mM ATP、10 mM MgCl2、0.5 M Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 M EDTA（pH 8.0）、0.5 M NaCl、0.1 M DTT和DNA连接底物按照一定比例混合，制备反应体系。

（2）加入T4 DNA连接酶
将T4 DNA连接酶加入反应体系中，使其达到一定浓度。

（3）反应
将反应体系在适当的温度下反应一定时间，停止反应。

（4）制备琼脂糖凝胶
将1%琼脂糖凝胶制备好。

（5）电泳
将反应产物和DNA连接底物在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后用UV照射仪检测。

4. 结果计算
根据反应产物的数量计算出T4 DNA连接酶的酶活。

二、杂质检测方法
1. 原理
T4 DNA连接酶杂质检测方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过检测反应产物中的杂质来判断T4 DNA连接酶的纯度。

2. 试剂和仪器
（1）T4 DNA连接酶
（2）10×T4 DNA连接酶反应缓冲液
（3）10 mM ATP
（4）10 mM MgCl2
（5）0.5 M Tris-HCl（pH 7.5）
（6）0.5 M EDTA（pH 8.0）
（7）0.5 M NaCl
（8）0.1 M DTT
（9）DNA连接底物
（10）1%琼脂糖凝胶
（11）电泳仪

3. 操作步骤
（1）制备反应体系
将10×T4 DNA连接酶反应缓冲液、10 mM ATP、10 mM MgCl2、0.5 M Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 M EDTA（pH 8.0）、0.5 M NaCl、0.1 M DTT和DNA连接底物按照一定比例混合，制备反应体系。

（2）加入T4 DNA连接酶
将T4 DNA连接酶加入反应体系中，使其达到一定浓度。

（3）反应
将反应体系在适当的温度下反应一定时间，停止反应。

（4）制备琼脂糖凝胶
将1%琼脂糖凝胶制备好。

（5）电泳
将反应产物和DNA连接底物在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后用电泳仪检测。

4. 结果判断
根据电泳结果判断T4 DNA连接酶的杂质含量。

相关标准
GB/T 34777-2017 T4 DNA连接酶 技术要求
GB/T 34778-2017 T4 DNA连接酶 包装、标志、运输和贮存
GB/T 34779-2017 T4 DNA连接酶 使用说明书
GB/T 34780-2017 T4 DNA连接酶 安全技术规范
GB/T 34781-2017 T4 DNA连接酶 样品准备方法